METODOLOGIE BIOMOLECOLARI

Anno accademico 2017/2018 - 1° anno
Docente: Angela Roberta Lo Piero
Crediti: 8
Organizzazione didattica: 200 ore d'impegno totale, 158 di studio individuale, 42 di lezione frontale
Semestre:

Obiettivi formativi

Fornire agli studenti conoscenze teoriche e pratiche delle principali tecniche utilizzate per l’analisi della struttura e la funzione delle biomolecole, dando particolare rilievo alle metodologie che hanno condotto allo sviluppo di nuove discipline come la genomica, la transcrittomica e la proteomica.


Prerequisiti richiesti

Conoscenze di base di Chimica generale, Chimica organica, Biochimica e Genetica agraria


Frequenza lezioni

Fortemente consigliata


Contenuti del corso

La manipolazione degli acidi nucleici. Southern e Northern blots. Marcatori molecolari ed analisi genomica. PCR qualitativa e quantitativa. Tecniche e vettori di clonaggio. La trasformazione genetica dei procarioti. Preparazione e analisi di genoteche. La tecnologia del DNA microarray e Ibridizzazione sottrattiva. Metodi di sequenziamento degli acidi nucleici. RNAseq. La trasformazione genetica degli eucarioti. Cisgenesis e Intragenesis. Genome editing. Vettori di espressione e proteine di fusione. Il DNA ricombinante nell’industria agroalimentare.


Testi di riferimento

1) Biochimica e biologia molecolare: Principi e Tecniche, Wilson K., Walker J., ed. Raffaello Cortina (sesta edizione).

2) Rao R., Leone A., Biotecnologie e genomica delle piante, Idelson-Gnocchi ed.

3) Articoli scientifici fornitit dal docente



Programmazione del corso

 *ArgomentiRiferimenti testi
1*Generalità su struttura e funzione degli acidi nucleici, replicazione del DNA, le classi di RNA, la sintesi proteica.Testo 1: cap 5 Testo 2: cap 1  
2*Le proprietà fisico-chimiche delle basi azotate dei nucleotidi: distribuzione elettronica ed assorbimento della luce; denaturazione e rinaturazione degli acidi nucleici; calcolo del Tm; influenza della composizione in basi e della forza ionica sul TmTesto 1: cap 5  
3*Gli enzimi impiegati nella tecnologia del DNA ricombinante: un’overview. Endonucleasi di restrizione, DNA ligasi, DNA polimerasi (I, II, III, IV e V), frammento di Klenow, trascrittasi inversa, fosfatasi alcalina, trasferasi terminale, metilasiTesto 1: cap 5  
4*Isolamento e separazione degli acidi nucleici: Isolamento del DNA da organismi procarioti ed eucarioti. Preparazione di DNA plasmidico. Isolamento dell’RNA totale e purificazione dell’mRNA tramite cromatografia di affinitàTesto 1: cap 5 
5*Vettori per il clonaggio genico: plasmidi, fagi, cosmidi, vettori BAC e YAC La trasformazione batterica e la selezione dei batteri ricombinanti: selezione con doppio antibiotico ed alfa-complementazione Testo 1: cap 6  
6*Elettroforesi degli acidi nucleici in gel di agarosio e di poliacrilamide Testo 1: cap 5-6-10 
7*La polymerase chain reaction PCR: principio ed applicazioni. Design di primers, allestimento di una reazione di PCR; Analisi dei prodotti di PCR su gel di agarosio. La RT -PCR. La PCR quantitativa: real time PCRTesto 1: cap 5 Testo 2: cap 2 
8*Southern e Northern blots, dot blots, trasferimento di DNA da placche di lisi fagica. Costruzione di librerie. Isolamento ed identificazione di geni clonati. Cenni sull’utilizzo dei tools bioinformatici di NCBI (ORF finder, BLAST)Testo 1: cap 5 Testo 2: cap 2  
9*Design e marcatura di sonde geniche con metodologie alternative al 32P: sistema biotina-streptavidina, marcatura con digossigenina. Enzimi reporter: fosfatasi alcalina e perossidasi di rafanoTesto 1: cap 14-5-7 
10*I metodi di sequenziamento del DNA: il metodo dei dideossiribonucleotidi (Sanger), il pirosequenziamento. PCR in emulsione, Bridge PCR. Le piattaforme di Next Generation Sequencing Testo 1: cap. 5 Testo 2: cap 2  
11*L’uso del microarray in studi di genomica funzionale e strutturale. L’analisi globale del trascrittoma: RNAseq. Metodi di arricchimento: la ibridizzazione soppressiva sottrativa (SSH) e la microdissezione laser.Testo 1: cap. 5-6 Testo 2: cap 2  
12*La trasformazione genetica degli eucarioti. Cisgenesis ed Intragenesis. Genome editing: tecnologia CRISP/cas9. Cenni sui sistemi meganucleasi, nucleasi a dita di zinco e TALENArticoli scientifici forniti dal docente 
13*La produzione di proteine da geni clonati: vettori di espressione. Produzione di proteine di fusione (GST-tag, His-tag).Testo 1: cap. 6-8 Testo 2: cap 2  
14*Elettroforesi delle proteine in gel di poliacrilamide. La separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico: isoelectrofocusing (IEF). Elettroforesi delle proteine bidimensionale: analisi del proteoma, MALDI-TOF. ProteomicaTesto 1: cap. 6-8 Testo 2: cap 2  
15*Marcatori molecolari: definizione e classificazione. Cenni sui marcatori RFLP, SSR, RAPD, e SNP.Testo 2: cap 2  
* Conoscenze minime irrinunciabili per il superamento dell'esame.

N.B. La conoscenza degli argomenti contrassegnati con l'asterisco è condizione necessaria ma non sufficiente per il superamento dell'esame. Rispondere in maniera sufficiente o anche più che sufficiente alle domande su tali argomenti non assicura, pertanto, il superamento dell'esame.

Verifica dell'apprendimento

Modalità di verifica dell'apprendimento

L’esame è scritto da svolgersi in due ore di tempo


Esempi di domande e/o esercizi frequenti

1. Descrivere una delle tecniche riportate in programma; 2. Disegnare i primers che consentono l'amplificazione di un DNA target; 3. Identificare i frammenti di DNA derivanti da un esperimento di digestione enzimatica con enzimi di restrizione.