BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Anno accademico 2022/2023 - Docente: Angela Roberta LO PIERORisultati di apprendimento attesi
L'obiettivo formativo del corso è fornire agli studenti conoscenze teoriche e pratiche delle principali tecniche utilizzate per l’analisi della struttura e la funzione delle biomolecole, dando particolare rilievo alle metodologie che hanno condotto allo sviluppo di nuove discipline come la genomica, la trascrittomica e la proteomica. In particolare i risultati attesi dell'apprendimento declinati secondo i Descrittori di Dublino sono:
Conoscenza e capacità di comprensione
Al termine del corso, lo studente avrà acquisito le conoscenze di base sulle principali metodologie sperimentali nell’ambito della biotecnologie molecolari applicate alle piante. Acquisirà conoscenza e capacità di comprensione del ruolo degli acidi nucleici e delle proteine e della loro analisi nei processi cellulari in condizioni normali e di stress.
Conoscenza e capacità di comprensione applicate
Al termine del corso, lo studente sarà in grado di tradurre le conoscenze teoriche in strumenti metodologici per la risoluzione di problemi scientifici e sarà in grado di elaborare i dati sperimentali e rappresentarli nella maniera più idonea. La capacità di applicare conoscenze e comprensione sarà valutata attraverso brevi relazioni che dovranno essere svolte dopo le attività di laboratorio e dallo svolgimento delle due domande relative a problemi sperimentali che sono parte integrante dell'esame finale.
Autonomia di giudizio
Al termine del corso, lo studente sarà in grado di rispondere a quesiti, sviluppare un ragionamento, descrivere i risultati di una prova sperimentale e avviare un processo di interpretazione dei dati.
Abilità comunicative
Lo studente sarà in grado di descrivere, discutere e definire l'applicabilità di argomenti teorici inclusi nei contenuti del corso. Queste abilità verranno valutate tramite le due domande aperte che sono parte integrante dell'esame finale.
Capacità
di apprendere
Al termine del corso, lo studente sarà in grado di sviluppare un ragionamento logico e misurarsi con informazioni nuove e di utilizzarle per diversi scopi.
Modalità di svolgimento dell'insegnamento
L'insegnamento (8 CFU) prevede 42 ore di lezione frontale e 28 ore di esercitazioni in laboratorio. Per le lezioni frontali il docente si avvarrà di presentazioni in power point e di filmati, anche in inglese. Le esercitazioni di laboratorio si svolgeranno sotto forma di minicorso su alcuni argomenti principali (ad esempio: estrazione di acidi nucleici, elettroforesi degli acidi nucleici e delle proteine, preparazione di DNA plasmidico e digestione con enzimi di restrizione).
A garanzia di pari opportunità e nel rispetto delle leggi vigenti, gli studenti interessati possono chiedere un colloquio personale in modo da programmare eventuali misure compensative e/o dispensative, in base agli obiettivi didattici ed alle specifiche esigenze. E' possibile rivolgersi anche al docente referente CInAP (Centro per l’inclusione Attiva e Partecipata - Servizi per le Disabilità e/o i DSA) del nostro Dipartimento.
Prerequisiti richiesti
Il corso non prevede propedeuticità. Nonostante ciò, sono necessarie, per poter seguire con profitto, adeguate conoscenze di Chimica generale, Chimica organica, Biochimica e Genetica agraria
Frequenza lezioni
La frequenza non è obbligatoria ma fortemente consigliata
Contenuti del corso
Concetti di base su struttura e funzioni di acidi nucleici e proteine. La manipolazione degli acidi nucleici. Southern e Northern blots. Marcatori molecolari ed analisi genomica. PCR qualitativa e quantitativa. Tecniche e vettori di clonaggio. La trasformazione genetica dei procarioti. Preparazione e analisi di genoteche. La tecnologia del DNA microarray e Ibridizzazione sottrattiva. Metodi di sequenziamento degli acidi nucleici. Genomica e trascrittomica. RNAseq. Epigenomica. Elettroforesi bidimensionale delle proteine e proteomica. La trasformazione genetica degli eucarioti. Cisgenesis e Intragenesis. Genome editing. Vettori di espressione e proteine di fusione. Il DNA ricombinante nell’industria agroalimentare.
Testi di riferimento
1) Biochimica e biologia molecolare: Principi e Tecniche, Wilson K., Walker J., ed. Raffaello Cortina (ottava edizione).
2) Rao R., Leone A., Biotecnologie e genomica delle piante, Idelson-Gnocchi ed.
3) Articoli scientifici forniti dal docente
Programmazione del corso
| Argomenti | Riferimenti testi | |
|---|---|---|
| 1 | Generalità su struttura e funzione degli acidi nucleici, replicazione del DNA, le classi di RNA (coding e non-coding), la sintesi proteica. | Testo 1: cap 4 Testo 2: cap 1 |
| 2 | Le proprietà fisico-chimiche delle basi azotate dei nucleotidi: distribuzione elettronica ed assorbimento della luce; denaturazione e rinaturazione degli acidi nucleici; calcolo del Tm; influenza della composizione in basi e della forza ionica sul Tm | Testo 1: cap 4 |
| 3 | Gli enzimi impiegati nella tecnologia del DNA ricombinante: un’overview. Endonucleasi di restrizione, DNA ligasi, DNA polimerasi (I, II, III, IV e V), frammento di Klenow, trascrittasi inversa, fosfatasi alcalina, trasferasi terminale, metilasi | Testo 1: cap 4 |
| 4 | Isolamento e separazione degli acidi nucleici: Isolamento del DNA da organismi procarioti ed eucarioti. Preparazione di DNA plasmidico. Isolamento dell’RNA totale e purificazione dell’mRNA tramite cromatografia di affinità | Testo 1: cap 4 |
| 5 | Vettori per il clonaggio genico: plasmidi, fagi, cosmidi, vettori BAC e YAC La trasformazione batterica e la selezione dei batteri ricombinanti: selezione con doppio antibiotico ed alfa-complementazione | Testo 1: cap 4 |
| 6 | Elettroforesi degli acidi nucleici in gel di agarosio e di poliacrilamide | Testo 1: cap 6 |
| 7 | La polymerase chain reaction PCR: principio ed applicazioni. Design di primers, allestimento di una reazione di PCR; Analisi dei prodotti di PCR su gel di agarosio. La RT -PCR. La PCR quantitativa: real time PCR | Testo 1: cap 4 Testo 2: cap 2 |
| 8 | Southern e Northern blots, dot blots, trasferimento di DNA da placche di lisi fagica. Costruzione di librerie. Isolamento ed identificazione di geni clonati. Cenni sull’utilizzo dei tools bioinformatici di NCBI (ORF finder, BLAST) | Testo 1: cap 4 Testo 2: cap 2 |
| 9 | Design e marcatura di sonde geniche con metodologie alternative al 32P: sistema biotina-streptavidina, marcatura con digossigenina. Enzimi reporter: fosfatasi alcalina e perossidasi di rafano | Testo 1: cap 4-9 |
| 10 | I metodi di sequenziamento del DNA: il metodo dei dideossiribonucleotidi (Sanger), il pirosequenziamento. PCR in emulsione, Bridge PCR. Le piattaforme di Next Generation Sequencing | Testo 1: cap. -20 Testo 2: cap 2 |
| 11 | L’uso del microarray in studi di genomica funzionale e strutturale. L’analisi globale del trascrittoma: RNAseq. Analisi dell'epigenoma. Metodi di arricchimento: la ibridizzazione soppressiva sottrativa (SSH) e la microdissezione laser. | Testo 1: cap. 4-20 Testo 2: cap 2 |
| 12 | La trasformazione genetica degli eucarioti. Cisgenesis ed Intragenesis. Genome editing: tecnologia CRISP/cas9. Cenni sui sistemi meganucleasi, nucleasi a dita di zinco e TALEN | Articoli scientifici forniti dal docente |
| 13 | La produzione di proteine da geni clonati: vettori di espressione. Produzione di proteine di fusione (GST-tag, His-tag). | Testo 1: cap. 5 Testo 2: cap 2 |
| 14 | Elettroforesi delle proteine in gel di poliacrilamide. La separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico: isoelectrofocusing (IEF). Elettroforesi delle proteine bidimensionale: analisi del proteoma, MALDI-TOF. Proteomica | Testo 1: cap. 21 Testo 2: cap 2 |
| 15 | Marcatori molecolari: definizione e classificazione. Cenni sui marcatori RFLP, SSR, RAPD, e SNP. | Testo 2: cap 2 |
Verifica dell'apprendimento
Modalità di verifica dell'apprendimento
L’esame è scritto da svolgersi in due ore di tempo e comprende sei quesiti di cui due a risposta aperta, due con risposte a multiscelta, e due problemi o esercizi sugli argomenti trattati. A ciascun esercizio verrà attribuito un punteggio massimo stabilito (5 o 6 punti), per un totale di 31 punti. Il raggiungimento del punteggio di 31/30 si traduce con il conferimento della votazione 30/30 e lode.
La valutazione delle due domande con risposte a multiscelta e dei due problemi/esercizi avverrà sulla base dei seguenti criteri:
0 punti
da 1 a 4 punti
Esercizio parzialmente svolto in maniera corretta
Esercizio svolto in maniera corretta
La valutazione della due domande a risposta aperta avverrà sulla base dei seguenti criteri: capacità di apprendimento e livello di approfondimento degli argomenti trattati, proprietà di sintesi e esposizione, e capacità di ragionamento dello studente. La relativa votazione segue il seguente schema:
0 punti
Conoscenza e comprensione argomento: Importanti carenze. Significative imprecisioni
Capacità di analisi e sintesi: Irrilevanti. Frequenti generalizzazioni. Incapacità di sintesi
Utilizzo di referenze: Completamente inappropriato
1 punto
Conoscenza e comprensione argomento: A livello soglia. Imperfezioni evidenti
Capacità di analisi e sintesi: Capacità appena sufficienti
Utilizzo di referenze: Appena appropriato
2 punti
Conoscenza e comprensione argomento: Conoscenza routinaria
Capacità di analisi e sintesi: E’ in grado di analisi e sintesi corrette. Argomenta in modo logico e coerente
Utilizzo di referenze: Utilizza le referenze standard
3 punti
Conoscenza e comprensione argomento: Conoscenza buona
Capacità di analisi e sintesi: Ha capacità di analisi e di sintesi buone. Gli argomenti sono espressi coerentemente
Utilizzo di referenze: Utilizza le referenze standard
4 punti
Conoscenza e comprensione argomento: Conoscenza più che buona
Capacità di analisi e sintesi: Ha notevoli capacità di analisi e di sintesi
Utilizzo di referenze: Ha approfondito gli argomenti
5 o 6 punti
Conoscenza e comprensione argomento: Conoscenza ottima
Capacità di analisi e sintesi: Ha notevoli capacità di analisi e di sintesi.
Utilizzo di referenze: Importanti approfondimenti.
Esempi di domande e/o esercizi frequenti
1. Descrivere una delle tecniche riportate in programma; 2. Disegnare i primers che consentono l'amplificazione di un DNA target; 3. Identificare i frammenti di DNA derivanti da un esperimento di digestione enzimatica con enzimi di restrizione.